基因編輯技術(shù)與動物模型構(gòu)建研討會日程

日期

時間

主題

詳細(xì)內(nèi)容

第一天上午

9:00-10:30

基因修飾技術(shù)簡介（一）

基因打靶與基因編輯技術(shù)（ZNF, TALENs，CRISPR/Cas9）介紹

基因編輯、基因修飾、基因打靶、轉(zhuǎn)基因、基因敲除、基因敲入等專業(yè)領(lǐng)域概念梳理

CRISPR/Cas9結(jié)構(gòu)和特點

如何使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對特定基因進行敲除或定點插入（詳細(xì)方法步驟）

拓展如何提高定點敲入效率等知識

10:30-10:45

休息

10:45-12:00

基因修飾技術(shù)簡介（二）

基因編輯工具Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14的結(jié)構(gòu)、特點、工作原理

如何使用Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14系統(tǒng)進行編輯

Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14與Cas9的比較

Cas9、Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14的應(yīng)用和技術(shù)展望

上午現(xiàn)場答疑

12:00-13:30

午飯及午休

第一天下午

13:30-14:00

CRISPR（sgRNA）設(shè)計方法和相關(guān)網(wǎng)站介紹

sgRNA設(shè)計方法和相關(guān)網(wǎng)站介紹

CRISPR（sgRNA）的在線設(shè)計（在線互動設(shè)計演練）

14:00-15:30

基因編輯實驗詳細(xì)操作

gRNA oligos模板退火

退火gRNA與線性化CRISPR/Cas9載體連接

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（DH5α），轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板培養(yǎng)，CRISPR/Cas9重組子細(xì)菌克隆挑取，擴大化培養(yǎng)，鑒定陽性克隆

細(xì)胞轉(zhuǎn)染（Electroperation，Nuclefection，Nanofection，X-fection）等介紹與應(yīng)用拓展

單細(xì)胞克隆篩選（有限稀釋法，濾紙法、環(huán)法、流式分選法等）方法介紹與應(yīng)用拓展

15:30-15:45

15:45-17:00

利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯動物細(xì)胞系

CRISPR/Cas9質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法

陽性細(xì)胞克隆篩選，基因修飾基因組DNA模板快速制備

目的靶基因的基因組DNA片段的PCR擴增，電泳檢測PCR產(chǎn)物

PCR產(chǎn)物退火變性，T7E1酶切，電泳鑒定基因修飾情況

17:00-17:30

CRISPR/Cas9關(guān)鍵點總結(jié)、歸納、拓展

基因編輯關(guān)鍵知識點歸納、總結(jié)和提煉

CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用拓展（如CAB基因敲入方法等介紹）

第二天上午

9:00-10:30

利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建基因敲除或敲入小鼠

基因工程小鼠的詳細(xì)分類與比較

小鼠受精卵分離和培養(yǎng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)顯微注射到小鼠受精卵

受精卵顯微注射后回輸?shù)酱心甘篌w內(nèi)

PCR和T7E1分析和鑒定基因敲除小鼠（Founder）

基因敲除小鼠基因敲除情況分析

CRISPR/Cas9構(gòu)建基因敲除小鼠詳細(xì)實驗流程歸納和總結(jié)

10:30-10:45

休息

10:45-11:15

利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建大動物模型

以大動物豬為例，進行詳細(xì)介紹基因編輯技術(shù)在大動物模型中的應(yīng)用

利用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因修飾大型動物（豬）流程

基因修飾大型動物優(yōu)勢

利用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因修飾大動物（豬）模型介紹

11:15-12:00

利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建動物模型的詳細(xì)案例介紹

利用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因修飾小鼠方法與相關(guān)基因修飾小鼠模型

利用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因修飾大動物（豬、猴）方法與相關(guān)基因修飾大動物模型

拓展基因編輯技術(shù)在其它物種中的應(yīng)用

拓展基因編輯技術(shù)在其它物種中的應(yīng)用

12:00-13:30

午飯及午休

第二天下午

13:30-15:00

實驗結(jié)果的點評與討論

CRISPR/Cas9載體構(gòu)建討論

目的靶基因的基因組DNA片段的PCR擴增，電泳檢測PCR產(chǎn)物結(jié)果討論

PCR產(chǎn)物T7E1酶切，電泳鑒定基因修飾情況結(jié)果討論

Sanger測序鑒定基因編輯結(jié)果：CRISPR/Cas9質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化子測序結(jié)果確認(rèn)；Sanger測序閱讀基因編輯情況；如何從測序色譜圖中閱讀靶向突變等位基因型

15:00-15:30

CRISPR/Cas9脫靶問題分析

脫靶產(chǎn)生的原因

脫靶檢測方法

降低脫靶問題的方法

15:30-15:45

15:45-16:30

基因編輯領(lǐng)域進展大梳理與全面拓展

基因編輯技術(shù)的應(yīng)用拓展介紹：SHERLOCK-V1、SHERLOCK-V2等應(yīng)用于檢測方面的拓展，Base editing

結(jié)合當(dāng)下新型冠狀病毒熱點，基因編輯工具用于檢測新型冠狀病毒、基因編輯工具有可能應(yīng)用于新冠治療等應(yīng)用的介紹與拓展

Cas系列突變體的介紹與應(yīng)用

基因編輯的拓展應(yīng)用（如應(yīng)用于杜氏營養(yǎng)肌不良綜合征、白內(nèi)障、消滅蚊子、植物中的應(yīng)用、細(xì)菌中的應(yīng)用等）

基因編輯工具的倫理問題于討論